DIN EN ISO 8069-2007

“ 45*66*6 ““ ““ 86472. 8647 8647 60 mg je 100 g fettfreier Trockenmasse 15 des relativen arithmetischen Mittelwerts. 10.3 Vergleichprzision Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Untersuchungsergebnissen, die unter Anwendung desselben Verfahrens an identischem Untersuchungsmaterial in verschiedenen Laboratorien durch verschiedene Bearbeiter mit verschiedenen Gerteausrstungen erhalten wurden, wird in nicht mehr als 5 der Flle grer als die folgenden sein a fr den arithmetischen Mittelwert des Gehalts an Milchsure und Lactaten d 100 mg je 100 g fettfreier fester Bestandteile 15 mg/100 g; b fr den arithmetischen Mittelwert des Gehalts an Milchsure und Lactaten 100 mg je 100 g fettfreier fester Bestandteile 20 des relativen arithmetischen Mittelwerts. 2 ISO 57251986, Precision of test s Determination of repeatability and reproducibility for a standard test by inter-laboratory tests jetzt zurckgezogen wurde verwendet, um die Przisionsdaten zu erhalten. EN ISO 80692007 D 12 11 Untersuchungsbericht Der Untersuchungsbericht muss enthalten a alle Angaben, die fr die vollstndige Identifizierung der Probe erforderlich sind; b das angewendete Probenahmeverfahren, falls bekannt; c das angewendete Untersuchungsverfahren mit Hinweis auf diese Internationale Norm; d Einzelheiten aller Arbeitsgnge, die nicht in dieser Internationalen Norm festgelegt sind oder als wahlweise erachtet wurden, sowie Einzelheiten aller Ereignisse, die das die Ergebnisse beeinflusst haben knnen; e das die erhaltenen Untersuchungsergebnisse und falls die Wiederholprzision geprft wurde, das endgltig berechnete Ergebnis, das erhalten wurde. EN ISO 80692007 D 13 Anhang A normativ Gute-Laborpraxis-GLP-Regeln fr die Durchfhrung enzymatischer Analysen A.1 Einleitung Gute-Laborpraxis-Regeln fr die Durchfhrung enzymatischer Analysen sind weniger bekannt, als solche fr andere chemische Analysen. Unbedingte Aufmerksamkeit muss auf diese Regeln gerichtet werden, um Ergebnisse mit einer zufriedenstellenden Exaktheit und Przision zu erzielen. Vor den Analysen sind die unten beschriebenen GLP-Regeln zu lesen. A.2 Chemikalien A.1.1 Es sind nur Enzyme der vorgeschriebener Gte spezifische Aktivitt, Konzentration, Verunreinigung mit enzymatischen Aktivitten, Lsungsmittel zu verwenden. A.1.2 Es sind nur Koenzyme der beschriebenen Gte Reinheitsgrad, in Salz- oder Sure, Verunreinigungen zu verwenden. A.1.3 Alle Chemikalien mssen, anders als die Enzyme und die Koenzyme, eine Analysenreinheit aufweisen. A.1.4 Das Wasser fr die Herstellung der Enzymlsungen und der anderen Reagenzien muss doppelt in einer Glasapparatur destilliert werden. A.1.5 Das Wasser fr die Herstellung der Probenlsungen muss in einer Glasapparatur destilliert oder deionisiert werden. A.1.6 Die Chemikalien und die Enzym-Suspensionen/-lsungen werden entsprechend der Vorschrift meistens zwischen 2 C und 8 C gelagert. A.1.7 Enzym-Suspensionen sollten nicht eingefroren werden. A.1.8 Wenn das Verfallsdatum einer Chemikalie berschritten wurde, wird die Chemikalie entweder verworfen oder die Wirksamkeit dieser Chemikalie wird mit Prfstandardlsungen mit unterschiedlichen Anteilen des Analyten berprft. Die erhaltene Extinktion muss proportional zu den Konzentrationen sein. A.1.9 Aus dem Khlschrank genommene Pufferlsungen mssen auf Raumtemperatur erwrmt werden, bevor sie zu der Untersuchungsmischung gegeben werden. A.3 Photometrische und spektralphotometrische Kvetten A.3.1 Kvetten aus Glas oder Kunststoff mit einer optischen Weglnge von 1 cm werden verwendet. ANMERKUNG Kunststoffkvetten haben gegenber Glaskvetten folgende Vorteile a sie sind preiswert Einwegkvetten; b eine groe Anzahl Analysen ist mglich; c Kunststoffkvetten innerhalb einer Charge stimmen sehr gut in Hinblick auf die Extinktion berein. EN ISO 80692007 D 14 A.3.2 Immer wenn eine neue Charge der Kvetten in Gebrauch genommen wird, ist ihre optische Weglnge gegen die einer Przisionskvette z. B. Quarzkvette wie folgt zu prfen. Die Przisionskvette und die Kunststoffkvetten werden mit Wasser gefllt und die Extinktion A1 jeder Kvette gegen Wasser gemessen. Nach dem Splen werden die Kvetten mit einer NADH-Lsung etwa 0,15 mg/l gefllt und die Extinktion A2 wieder gegen Wasser gemessen. Sowohl fr die Przisionskvette als auch fr die Kunststoffkvetten wird A2 A1 berechnet. Falls die Differenz A2 A1 zwischen den zwei Kvettentypen 0,5 der Netto-Extinktionsmessung der Przisionskvette berschreitet, wird die durchschnittliche prozentuale Differenz berechnet und diese als Weglnge, l, in Gleichung 3 angesehen. A.3.3 Es sind immer saubere und unzerkratzte Kvetten zu verwenden. Die optischen Seiten der Kvetten werden nur mit einem weichen Tuch getrocknet oder gereinigt. A.3.4 Es ist ratsam, die Extinktion der Kvetten der Untersuchungsprobe nicht gegen die Kvette der Blindprobe zu messen, weil so keine Inationen ber die Grenordnung der Extinktion der Blindprobe selbst erhalten werden. A.3.5 Die Extinktion einer Proben- oder Blindversuchs-Kvette darf nicht gegen eine leere Kvette wegen der Lichtdiffusion gemessen werde. A.3.6 Der Inhalt der Kvetten wird mit einer Kunststoffschaufel oder durch versiegeln der Kvette mit Parafilm und leichtes Umherschwenken gemischt. A.3.7 Luftblasen an den Kvettenwnden werden mit der Schaufel entfernt. Ein Zerkratzen der optischen Seite der Kvette ist zu vermeiden. A.3.8 Es wird immer die gleiche Kvettenart fr die Messung der Untersuchungsprobe und der Blindprobe verwendet. A.3.9 Die Glas- oder Quarzkvetten werden immer in der gleichen Position in den Kvettenhalter eingesetzt. Zu diesem Zweck wird eine optische Seite der Kvette markiert. A.4 Photometer und Spektralphotometer A.4.1 Es werden ein Spektralphotometer Bandbreite d 10 nm, ein Filterphotometer, ausgestattet mit einem Interferenzfilter Bandbreite d 10 nm oder ein Spektrallinien-Photometer, ausgerstet mit einer Quecksilberdampflampe verwendet. Messungen, die mit einem Spektralphotometer oder einem Filterphotometer erfolgen, mssen bei dem Extinktionsmaximum von NADH oder NADPH, d. h. 340 nm, durchgefhrt werden. Erfolgen diese Messungen mit einem Spektrallinien-Photometer mit einer Quecksilberdampflampe mssen diese bei 365 nm oder 334 nm erfolgen. ANMERKUNG Die molaren Extinktionskoeffizienten von NADH oder NADPH, gemessen bei 334 nm, 340 nm und 365 nm sind wie folgt a NADH und NADPH bei 334 nm Hg 6,18 u 106 cm2/mol; b NADH und NADPH bei 340 nm 6,3 u 106 cm2/mol; c NADPH bei 365 nm Hg 3,5 u 106 cm2/mol; d NADH bei 365 nm 3,4 u 106 cm2/mol. EN ISO 80692007 D A.4.2 Zwischen der Extinktion und der Konzentration von NADH oder NADPH muss ein lineares Verhltnis gem einer Extinktion von 2,0 vorhanden sein. Die Linearitt wird wie folgt geprft a 2,00 ml destilliertes Wasser werden in eine Kvette pipettiert und die Extinktion A0 gegen Wasser gemessen; b 0,10 ml NADH-Lsung 0,5 mg/ml werden in eine Kvette pipettiert; der Inhalt der Kvette wird gemischt und die Extinktion A1 gemessen. Die reduzierte Extinktion, Arn, wird mit folgender Gleichung berechnet 53 12011r ,,u AAA Das Linearittsprfverfahren wird 14-mal, wie oben beschrieben, durchgefhrt. Nach jedem Messungspaar wird die reduzierte Extinktion, Arn, mit folgender Gleichung berechnet 530r ,VAAA nn u Dabei ist An die nach der Messung n erhaltene Extinktion; V das Volumen des Kvetteninhalts bei der Messung n. Fr jede Messung wird das in der Kvette vorhandene Volumen der NADH-Lsung gegen die entsprechenden reduzierten Extinktionen aufgezeichnet. Der Korrelationswert der Messungen sollte 0,99 sein. A.5 Automatische Pipetten und Dispenser A.5.1 Automatische Pipetten und andere Dispenser Probengeber werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers angewendet. A.5.2 Fr jede Pipette wird die geeignete Spitze verwendet. A.5.3 Die Spezifikationen des Volumens und der Wiederholprzision von automatischen Pipetten oder anderen Dispensern werden regelmig z. B. monatlich wie folgt geprft. Ein Becherglas mit Wasser wird zum Zeitpunkt t gewogen. 1 Maeinheit Wasser wird in den Becher pipettiert oder verteilt und genau t 1 min nach dem ersten Wiegen gewogen. Das Pipettier- oder Verteilungsverfahren wird neunmal wiederholt. Der Becher wird ohne das Pipettieren oder Verteilen zum Zeitpunkt t 11 min, t 12 min, t 13 min, t 14 min und t 15 min gewogen. Von diesen Massen wird der Verdunstungsverlust je Minute berechnet. Das Volumen und die Wiederholprzision der Pipette oder des Dispensers werden unter Bercksichtigung des Wasserverlustes durch Verdunstung berechnet. A.5.4 Wird Wrme vom Handteller whrend des anhaltenden Gebrauchs bertragen, kann das Volumen von einigen automatischen Pipetten beeinflusst werden. Diese Erscheinung wird durch die in A.5.3 beschriebene Verfahrensweise berprft und der Gebrauch dieser Pipetten wird vermieden. 15 EN ISO 80692007 D 16 A.5.5 Kurz vor dem Gebrauch wird die Spitze der Pipette mehrmals mit der zu verdnnenden Lsung/Suspension gesplt. Fr jede Probenlsung wird eine neue Pipettenspitze verwendet. A.5.6 Die Probe-, Puffer-, Enzym- und Koenzymlsung wird, whrend die Spitze so tief wie mglich reicht, in verschiedene Ecken der Kvette pipettiert. Kleine Mengen Enzymlsungen/-suspensionen 10 bis 50 l knnen auf die Schaufel pipettiert, in die Kvette eingegeben und mit dem Kvetteninhalt mit der Schaufel gemischt werden. A.5.7 Verunreinigungen sind zu vermeiden. A.6 Andere ntzliche Inationen A.6.1 Wegen mglicher Interferenzen und grober Fehler bei der Bestimmung wird die Extinktion mit zwei Lsungen mit unterschiedlichen Analyt-Konzentrationen berprft. Die erhaltenen Extinktionen mssen proportional zu der Analytenkonzentration sein. A.6.2 Um die enzymatischen Reaktionen zu berprfen, wird ein Standard verwendet. Dieser Standard muss als Arbeitsstandard betrachtet werden. ANMERKUNG Referenzmaterialien mit einer zertifizierten Reinheit knnen von Organisationen wie dem National Institut of Standards and Technology NIST oder dem European Community Bureau of Reference BCR bezogen werden. A.6.3 Ein Wiederfindungsversuch in der Anwesenheit der Probenlsung wird durchgefhrt. Der Anteil des zugegebenen Analyten muss etwa gleich dem bereits in der Probenlsung vorhandenen sein. A.6.4 Je Kvette wird eine Kunststoffschaufel verwendet oder jede Schaufel wird nur einmal verwendet. ANMERKUNG Der auf der Schaufel zurckbleibende Flssigkeitsanteil kann vernachlssigt werden. EN ISO 80692007 D 17 Literaturhinweise 1 ISO 707IDF 50, Milk and milk products Guidance on sampling 2 ISO 1736, Dried milk and dried milk products Determination of fat content Gravimetric Reference 3 ISO 5725-11994, Accuracy trueness and precision of measurement s and results Part 1 General principles and definitions 4 ISO 5725-21994, Accuracy trueness and precision of measurement s and results Part 2 Basic for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement 5 Leenheer, J. und Jans, J.A., Bulletin of the IDF, Nr. 207, 1986, S. 122132