DIN EN ISO 8069-2007





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    !$ 86472.  $ 8647+  $ 8647 60 mg je 100 g fettfreier Trockenmasse: 15 % des (relativen) arithmetischen Mittelwerts. 10.3 Vergleichpräzision Die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Untersuchungsergebnissen, die unter Anwendung desselben Verfahrens an identischem Untersuchungsmaterial in verschiedenen Laboratorien durch verschiedene Bearbeiter mit verschiedenen Geräteausrüstungen erhalten wurden, wird in nicht mehr als 5 % der Fälle größer als die folgenden sein: a) für den arithmetischen Mittelwert des Gehalts an Milchsäure und Lactaten d 100 mg je 100 g fettfreier fester Bestandteile: 15 mg/100 g; b) für den arithmetischen Mittelwert des Gehalts an Milchsäure und Lactaten 100 mg je 100 g fettfreier fester Bestandteile: 20 % des (relativen) arithmetischen Mittelwerts. 2) ISO 5725:1986, Precision of test methods — Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (jetzt zurückgezogen) wurde verwendet, um die Präzisionsdaten zu erhalten. EN ISO 8069:2007 (D) 12 11 Untersuchungsbericht Der Untersuchungsbericht muss enthalten: a) alle Angaben, die für die vollständige Identifizierung der Probe erforderlich sind; b) das angewendete Probenahmeverfahren, falls bekannt; c) das angewendete Untersuchungsverfahren mit Hinweis auf diese Internationale Norm; d) Einzelheiten aller Arbeitsgänge, die nicht in dieser Internationalen Norm festgelegt sind oder als wahlweise erachtet wurden, sowie Einzelheiten aller Ereignisse, die das (die) Ergebnis(se) beeinflusst haben können; e) das (die) erhaltene(n) Untersuchungsergebnis(se) und falls die Wiederholpräzision geprüft wurde, das endgültig berechnete Ergebnis, das erhalten wurde. EN ISO 8069:2007 (D) 13 Anhang A (normativ) Gute-Laborpraxis-(GLP-)Regeln für die Durchführung enzymatischer Analysen A.1 Einleitung Gute-Laborpraxis-Regeln für die Durchführung enzymatischer Analysen sind weniger bekannt, als solche für andere chemische Analysen. Unbedingte Aufmerksamkeit muss auf diese Regeln gerichtet werden, um Ergebnisse mit einer zufriedenstellenden Exaktheit und Präzision zu erzielen. Vor den Analysen sind die unten beschriebenen GLP-Regeln zu lesen. A.2 Chemikalien A.1.1 Es sind nur Enzyme der vorgeschriebener Güte (spezifische Aktivität, Konzentration, Verunreinigung mit enzymatischen Aktivitäten, Lösungsmittel) zu verwenden. A.1.2 Es sind nur Koenzyme der beschriebenen Güte (Reinheitsgrad, in Salz- oder Säureform, Verunreinigungen) zu verwenden. A.1.3 Alle Chemikalien müssen, anders als die Enzyme und die Koenzyme, eine Analysenreinheit aufweisen. A.1.4 Das Wasser für die Herstellung der Enzymlösungen und der anderen Reagenzien muss doppelt in einer Glasapparatur destilliert werden. A.1.5 Das Wasser für die Herstellung der Probenlösungen muss in einer Glasapparatur destilliert oder deionisiert werden. A.1.6 Die Chemikalien und die Enzym-Suspensionen/-lösungen werden entsprechend der Vorschrift (meistens zwischen 2 °C und 8 °C) gelagert. A.1.7 Enzym-Suspensionen sollten nicht eingefroren werden. A.1.8 Wenn das Verfallsdatum einer Chemikalie überschritten wurde, wird die Chemikalie entweder verworfen oder die Wirksamkeit dieser Chemikalie wird mit Prüfstandardlösungen mit unterschiedlichen Anteilen des Analyten überprüft. Die erhaltene Extinktion muss proportional zu den Konzentrationen sein. A.1.9 Aus dem Kühlschrank genommene Pufferlösungen müssen auf Raumtemperatur erwärmt werden, bevor sie zu der Untersuchungsmischung gegeben werden. A.3 Photometrische und spektralphotometrische Küvetten A.3.1 Küvetten aus Glas oder Kunststoff mit einer optischen Weglänge von 1 cm werden verwendet. ANMERKUNG Kunststoffküvetten haben gegenüber Glasküvetten folgende Vorteile: a) sie sind preiswert (Einwegküvetten); b) eine große Anzahl Analysen ist möglich; c) Kunststoffküvetten innerhalb einer Charge stimmen sehr gut in Hinblick auf die Extinktion überein. EN ISO 8069:2007 (D) 14 A.3.2 Immer wenn eine neue Charge der Küvetten in Gebrauch genommen wird, ist ihre optische Weglänge gegen die einer Präzisionsküvette (z. B. Quarzküvette) wie folgt zu prüfen. Die Präzisionsküvette und die Kunststoffküvetten werden mit Wasser gefüllt und die Extinktion (A1) jeder Küvette gegen Wasser gemessen. Nach dem Spülen werden die Küvetten mit einer NADH-Lösung (etwa 0,15 mg/l) gefüllt und die Extinktion (A2) wieder gegen Wasser gemessen. Sowohl für die Präzisionsküvette als auch für die Kunststoffküvetten wird A2  A1 berechnet. Falls die Differenz (A2  A1) zwischen den zwei Küvettentypen 0,5 % der Netto-Extinktionsmessung der Präzisionsküvette überschreitet, wird die durchschnittliche prozentuale Differenz berechnet und diese als Weglänge, l, in Gleichung (3) angesehen. A.3.3 Es sind immer saubere und unzerkratzte Küvetten zu verwenden. Die optischen Seiten der Küvetten werden nur mit einem weichen Tuch getrocknet oder gereinigt. A.3.4 Es ist ratsam, die Extinktion der Küvetten der Untersuchungsprobe nicht gegen die Küvette der Blindprobe zu messen, weil so keine Informationen über die Größenordnung der Extinktion der Blindprobe selbst erhalten werden. A.3.5 Die Extinktion einer Proben- oder Blindversuchs-Küvette darf nicht gegen eine leere Küvette (wegen der Lichtdiffusion) gemessen werde. A.3.6 Der Inhalt der Küvetten wird mit einer Kunststoffschaufel oder durch versiegeln der Küvette mit Parafilm und leichtes Umherschwenken gemischt. A.3.7 Luftblasen an den Küvettenwänden werden mit der Schaufel entfernt. Ein Zerkratzen der optischen Seite der Küvette ist zu vermeiden. A.3.8 Es wird immer die gleiche Küvettenart für die Messung der Untersuchungsprobe und der Blindprobe verwendet. A.3.9 Die Glas- oder Quarzküvetten werden immer in der gleichen Position in den Küvettenhalter eingesetzt. Zu diesem Zweck wird eine optische Seite der Küvette markiert. A.4 Photometer und Spektralphotometer A.4.1 Es werden ein Spektralphotometer (Bandbreite d 10 nm), ein Filterphotometer, ausgestattet mit einem Interferenzfilter (Bandbreite d 10 nm) oder ein Spektrallinien-Photometer, ausgerüstet mit einer Quecksilberdampflampe verwendet. Messungen, die mit einem Spektralphotometer oder einem Filterphotometer erfolgen, müssen bei dem Extinktionsmaximum von NADH oder NADPH, d. h. 340 nm, durchgeführt werden. Erfolgen diese Messungen mit einem Spektrallinien-Photometer mit einer Quecksilberdampflampe müssen diese bei 365 nm oder 334 nm erfolgen. ANMERKUNG Die molaren Extinktionskoeffizienten von NADH oder NADPH, gemessen bei 334 nm, 340 nm und 365 nm sind wie folgt: a) NADH und NADPH bei 334 nm (Hg): 6,18 u 106 cm2/mol; b) NADH und NADPH bei 340 nm: 6,3 u 106 cm2/mol; c) NADPH bei 365 nm (Hg): 3,5 u 106 cm2/mol; d) NADH bei 365 nm: 3,4 u 106 cm2/mol. EN ISO 8069:2007 (D) A.4.2 Zwischen der Extinktion und der Konzentration von NADH oder NADPH muss ein lineares Verhältnis gemäß einer Extinktion von 2,0 vorhanden sein. Die Linearität wird wie folgt geprüft: a) 2,00 ml destilliertes Wasser werden in eine Küvette pipettiert und die Extinktion A0 gegen Wasser gemessen; b) 0,10 ml NADH-Lösung (0,5 mg/ml) werden in eine Küvette pipettiert; der Inhalt der Küvette wird gemischt und die Extinktion A1 gemessen. Die reduzierte Extinktion, Arn, wird mit folgender Gleichung berechnet: 53 12011r ,,u AAA Das Linearitätsprüfverfahren wird 14-mal, wie oben beschrieben, durchgeführt. Nach jedem Messungspaar wird die reduzierte Extinktion, Arn, mit folgender Gleichung berechnet: 530r ,VAAA nn u Dabei ist An die nach der Messung n erhaltene Extinktion; V das Volumen des Küvetteninhalts bei der Messung n. Für jede Messung wird das in der Küvette vorhandene Volumen der NADH-Lösung gegen die entsprechenden reduzierten Extinktionen aufgezeichnet. Der Korrelationswert der Messungen sollte 0,99 sein. A.5 Automatische Pipetten und Dispenser A.5.1 Automatische Pipetten und andere Dispenser (Probengeber) werden entsprechend den Anweisungen des Herstellers angewendet. A.5.2 Für jede Pipette wird die geeignete Spitze verwendet. A.5.3 Die Spezifikationen des Volumens und der Wiederholpräzision von automatischen Pipetten oder anderen Dispensern werden regelmäßig (z. B. monatlich) wie folgt geprüft. Ein Becherglas mit Wasser wird zum Zeitpunkt t gewogen. 1 Maßeinheit Wasser wird in den Becher pipettiert oder verteilt und genau (t  1) min nach dem ersten Wiegen gewogen. Das Pipettier- oder Verteilungsverfahren wird neunmal wiederholt. Der Becher wird ohne das Pipettieren oder Verteilen zum Zeitpunkt (t  11) min, (t  12) min, (t  13) min, (t  14) min und (t  15) min gewogen. Von diesen Massen wird der Verdunstungsverlust je Minute berechnet. Das Volumen und die Wiederholpräzision der Pipette oder des Dispensers werden unter Berücksichtigung des Wasserverlustes durch Verdunstung berechnet. A.5.4 Wird Wärme vom Handteller während des anhaltenden Gebrauchs übertragen, kann das Volumen von einigen automatischen Pipetten beeinflusst werden. Diese Erscheinung wird durch die in A.5.3 beschriebene Verfahrensweise überprüft und der Gebrauch dieser Pipetten wird vermieden. 15 EN ISO 8069:2007 (D) 16 A.5.5 Kurz vor dem Gebrauch wird die Spitze der Pipette mehrmals mit der zu verdünnenden Lösung/Suspension gespült. Für jede Probenlösung wird eine neue Pipettenspitze verwendet. A.5.6 Die Probe-, Puffer-, Enzym- und Koenzymlösung wird, während die Spitze so tief wie möglich reicht, in verschiedene Ecken der Küvette pipettiert. Kleine Mengen Enzymlösungen/-suspensionen (10 bis 50) µl können auf die Schaufel pipettiert, in die Küvette eingegeben und mit dem Küvetteninhalt mit der Schaufel gemischt werden. A.5.7 Verunreinigungen sind zu vermeiden. A.6 Andere nützliche Informationen A.6.1 Wegen möglicher Interferenzen und grober Fehler bei der Bestimmung wird die Extinktion mit zwei Lösungen mit unterschiedlichen Analyt-Konzentrationen überprüft. Die erhaltenen Extinktionen müssen proportional zu der Analytenkonzentration sein. A.6.2 Um die enzymatische(n) Reaktion(en) zu überprüfen, wird ein Standard verwendet. Dieser Standard muss als Arbeitsstandard betrachtet werden. ANMERKUNG Referenzmaterialien mit einer zertifizierten Reinheit können von Organisationen wie dem National Institut of Standards and Technology (NIST) oder dem European Community Bureau of Reference (BCR) bezogen werden. A.6.3 Ein Wiederfindungsversuch in der Anwesenheit der Probenlösung wird durchgeführt. Der Anteil des zugegebenen Analyten muss etwa gleich dem bereits in der Probenlösung vorhandenen sein. A.6.4 Je Küvette wird eine Kunststoffschaufel verwendet oder jede Schaufel wird nur einmal verwendet. ANMERKUNG Der auf der Schaufel zurückbleibende Flüssigkeitsanteil kann vernachlässigt werden. EN ISO 8069:2007 (D) 17 Literaturhinweise [1] ISO 707°IDF 50, Milk and milk products — Guidance on sampling [2] ISO 1736, Dried milk and dried milk products — Determination of fat content — Gravimetric method (Reference method) [3] ISO 5725-1:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1: General principles and definitions [4] ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method [5] Leenheer, J. und Jans, J.A., Bulletin of the IDF, Nr. 207, 1986, S. 122–132